اشرشیا کلی (E.coli)، گرم منفی میله‌ای شکل

رنگ آمیزی گرم از پروتئوس میرابیلیس  (P.mirabilis) در نمونه ادرار به همراه لوکوسیت‌ها، باسیل‌های گرم منفی کوتاه، متوسط تا بلند که نشان دهنده ظاهر طبیعی باسیل‌های گرم منفی روده‌ای می‌باشد.

 کلنی سراشیا مارسیسنس (S.marcescens)، ظاهر محدب و دایره‌ای شکل کشت یافته بر روی تریپتیک سوی آگار

اشرشیا کلی کشت یافته روی ائوزین متیلن بلو آگار، باسیل گرم منفی کولی فرم با جلای سبز فلزی که نشان دهنده‌ی تولید اسید از تخمیر لاکتوز می باشد.

انتروباکتر آئروژنز روی ائوزین متیلن بلو آگار (E.aerogenes)، باسیل گرم منفی کلی فرم با ظاهر کلنی‌های موکوئیدی و با مرکز قهوه‌ای یا سیاه که نشان دهنده‌ی تخمیر لاکتوز و تولید اسید می‌باشد.

کلبسیلا پنومونیه بر روی ائوزین متیلن بلو آگار، باسیل گرم منفی کلی فرم با ظاهر کلنی‌های موکوئیدی و با مرکز قهوه‌ای یا سیاه (کوچک‌تر از انتروباکتر) که نشان دهنده‌ی تخمیر لاکتوز و تولید اسید می‌باشد.

پروتئوس ولگاریس روی ائوزین متیلن بلو آگار (P.vulgaris)، باسیل گرم منفی کولی فرم با ظاهر کلنی‌های صورتی رنگ که لاکتوز را تخمیر نمی‌کنند و بعضی اسیدها را تولید می‌کنند.

کشت مخلوط از اشرشیا کلی و سودوموناس آئروژینوزا روی ائوزین متیلن بلو، کلنی‌های اشرشیا کلی با ظاهر سبزو جلای فلزی که نشان دهنده‌ی تخمیر لاکتوز است و کلنی‌های صورتی رنگ سودوموناس آئروژینوزا که عدم تخمیر لاکتوز را نشان می دهد.

کلبسیلا پنومونیه در رنگ آمیزی کپسول به روش آنتونی.

اشرشیا کلی کشت یافته بر روی محیط مک کانکی، باکتری‌های تخمیر کننده لاکتوز در این محیط کشت صورتی متمایل به رنگ قرمز هستند.

پلیت مک کانکی آگار، اشرشیا کلی تخمیر کنده لاکتوز (کلنی‌های صورتی پر رنگ) و سراشیا مارسیسنس لاکتوز را تخمیر نمی کند (کلنی‌های بی‌رنگ).

پلیت مک کانکی آگار، تلقیح داده شده توسط اشرشیا کلی و سالمونلا تیفی میوریوم به روش خطی یا نواری

پلیت مک کانکی آگار، تلقیح داده شده با شیگلا سونئی، تخمیر کننده تاخیری لاکتوز (کلنی های صورتی کم رنگ)، اشرشیا کلی تخمیرکننده لاکتوز و سراشیا مارسیسنس که لاکتوز را تخمیر نمی کند.

پلیت مک کانکی آگار، تلقیح مخلوط از اشرشیا کولی ( قرمز) و کلبسیلا پنومونیه (صورتی) توسط روش کشت خطی.

 پلیت مک کانکی آگار، تلقیح مخلوط از اشرشیا کلی ( قرمز) و انترو باکتر آئروژنز (صورتی) توسط روش کشت خطی.

پیگمان‌های قرمز سراشیا مارسیسنس، دانشجویان معمولاً پیگمان قرمز را با تخمیر لاکتوز اشتباه می‌کنند.

فلور نرمال مدفوع، باکتری‌های تخمیر کننده، مخلوط با شیگلا سونئی (S.sonnei) (غیر تخمیر کننده لاکتوز)

کلبسیلا پنومونیه، کلنی‌های موکوئیدی و تخمیر کننده لاکتوز که از خصوصیات بارز گونه‌های کلبسیلا و انتروباکتر است.

 فلور نرمال مدفوع مخلوط با سالمونلا، این سویه غیر معمول سالمونلا لاکتوز را تخمیر کرده است. کلنی‌ها توسط تولید H₂S در محیط کشت هکتون تشخیص داده شده‌اند.

پروتئوس ولگاریس، عدم تخمیر لاکتوز با سوآرمینگ خفیف.

خانواده انتروباکتریاسه بر روی آگار خون دار ۵% تهیه شده از خون گوسفند، کلنی‌های غیر همولیتیک بزرگ، تیره و خاکستری رنگ مشاهده می‌شوند. همولیز در این خانواده متغیر است و معمولاً نمی‌توان آن‌را از روی یک جنس تشخیص داد.

خانواده انتروباکتریاسه روی آگار خون دار ۵٪ تهیه شده از خون گوسفند، مورگانلا مورگانئی (M.morganii)، سویه بتا همولیتیک، کلنی‌های بزرگ، خاکستری رنگ و مرطوب. همولیز در این خانواده متغیراست وکلنی تعدادی از گونه‌ها با هم شبیه هستند.

خانواده انتروباکتریاسه روی آگار خون دار ۵% تهیه شده از خون گوسفند، سراشیا مارسیسنس با پیگمان قرمز.

خانواده انتروباکتریاسه روی آگار خون دار ۵% تهیه شده از خون گوسفند، سوآرمینگ پروتئوس، این باکتری متحرک است و با سوآرمینگ بر سطح محیط جامد حرکت می‌کند. این باکتری دارای فلاژل است و به صورت یک لایه موج‌دار از خط تلقیح در سطح محیط منتشر می‌شود. این عکس حالت سوآرمینگ را از یک کلنی بر روی محیط کشت تازه نشان می‌دهد.

سوآرمینگ پروتئوس بر روی آگار خون دار ۵% تهیه شده از خون گوسفند، سوآرمینگ پروتئوس در محیط با رطوبت کم حلقه‌های محدود سوآرمینگ حاصل از دو کلنی.

 کشت چهار جهتی (چهار خطی)، سویه db11 سراشیا مارسیسنس کشت یافته بر روی محیط تریپتی کاز سوی اگار.

کشت چهار جهتی ( چهار خطی)، اشرشیا کلی 25922 ATCC روی آگار خون دار ۵% تهیه شده از خون گوسفند.

آزمایش دکربوکسیلاز و دی هیدروژناز

آنزیم دکربوکسیلاز گروه کربوکسیل را از آمینواسیدهای لیزین و اورنیتین جدا می‌کند. آنزیم دی‌هیدرولاز گروه کربوکسیل را از آرژنین جدا می کند. لوله آزمایش سمت چپ پایه گلوکز بدون آمینو اسید است (لوله شاهد) که به آن باکتری تلقیح نشده است. به سایر لوله‌های آزمایش که حاوی گلوکز به اضافه ی آمینو اسیدها هستند، باکتری تلقیح شده است. واکنش‌های دکربوکسیلاسیون و دی‌هیدرولاسیون در شرایط بی‌هوازی انجام می‌شود. بنابراین روی سطح مایع در لوله آزمایش با روغن معدنی استریل پوشانده می‌شود. در ابتدا رنگ مایع در همه لوله‌ها زرد می‌شود که به‌علت ایجاد شرایط اسیدی و تغییر رنگ معرف (برموکروزل ارغوانی) می‌باشد. تخمیر گلوکز اسید تولید می کند. در صورتی که آمینو اسید دکربوکسیله شود، محصولات ایجاد شده قلیایی هستند و موجب تغییر رنگ معرف و ارغوانی شدن محیط می‌شوند. در لوله آزمایش دوم از سمت چپ آرژنین و در لوله آزمایش سمت راست اورنیتین دکربوکسیله شده است و دکربوکسیلاسیون لیزین (سومین لوله آزمایش از سمت چپ) نتیجه منفی دارد. 

در آگار TSI (سمت چپ) تخمیر سه قند گلوکز، لاکتوز و سوکروز، تولید H₂S و گاز بررسی می‌شود. این محیط حاوی گلوکز به نسبت یک دهم لاکتوز و سوکروز، سیترات آمونیوم فریک و معرف فنل رد است. اگر ارگانیسم فقط گلوکز را تخمیر کند کل لوله شامل قسمت شیب دار و عمق اسیدی (زرد رنگ) می‌شود. اما باکتری پروتئین‌ها رانیز در سطح آگار تجزیه می‌کند و محصولات قلیایی تولید شده، باعث صورتی شدن قسمت شیب‌دار محیط می‌شود.

اگر لاکتوز یا سوکروز تخمیر شود، به علت غلظت بالای این قندها در محیط کل لوله زرد می‌شود. اگر H₂S تولید شود، با سیترات آمونیوم فریک موجود، رسوب سیاه رنگ سولفید آهن ایجاد می‌کند. تولید گاز از طریق ایجاد حباب یا بالا رفتن محیط کشت در لوله مشخص می‌شود. لوله آزمایش r/b₁ (سمت راست) یک سیستم تشخیصی تجارتی است. درقسمت بالای لوله ۵ واکنش تخمیر گلوکز و لاکتوز، تولید گاز و H₂S و فنیل آلانین آمیناز انجام می‌شود.

در قسمت پایین لوله در شرایط بی‌هوازی، آزمایش لیزین دکربوکسیلاز انجام می‌شود. این واکنش در شرایط بی‌هوازی انجام می‌شود. قسمت پایین در ابتدا زرد رنگ است که به علت دکربوکسیلاسیون لیزین و ایجاد شرایط اسیدی و تغییر رنگ معرف (برموکروزل ارغوانی) می‌باشد. در TSI مشاهده شده این عکس، گلوکز تخمیر شده و H₂S تولید شده است. به علت تولید H₂S و ایجاد رنگ سیاه، رنگ زرد در قسمت پایین لوله مشخص نیست. همین واکنش‌ها در قسمت بالای لوله r/b₁  انجام شده است و در قسمت پایین آن آزمایش لیزین دکربوکسیلاز مثبت است. باکتری تلقیح داده شده گونه ای از سالمونلا می‌باشد.

واکنش های مختلف بر روی محیط شیب دار TSI، واکنش‌های ۱۰ لوله TSI به ترتیب از چپ به راست نوشته شده است.

واکنش‌های مختلف بر روی محیط r/b₁، واکنش‌های ۸ لوله r/b₁  به ترتیب از چپ به راست نوشته شده است.

واکنش روی محیط شیب دار TSI ، لاکتوز و سوکروز تخمیر شده (مثل اشرشیا کلی).

اسید / اسید

واکنش روی محیط شیب دار TSI، گلوکوز تخمیر شده (مثل مورگانلا مورگانئی)

آلکالین / اسید

واکنش روی محیط شیب دار TSI، گلو کز تخمیر شده و H₂S تولید شده ( مثل پروتئوس میرابیلیس) 

آلکالین / اسید + H₂S

 واکنش روی محیط شیب دار TSI ، لاکتوز و سوکروز تخمیر شده و H₂S تولید شده مثل سیترو باکتر فروندی (C.freundii)

اسید / اسید + H₂S

واکنش روی محیط شیب دار TSI، تخمیر انجام نشده است (سودوموناس آئروژینوزا)

آلکالین / آلکالین 

 انتروباکتریاسه روی محیط هکتون انتریک آگار

اغلب گونه‌های انتروباکتریاسه، به‌جز انواع تخمیر کننده ی سریع لاکتوز (برخی گونه های اشرشیا، کلبسیلا، انتروباکتر و سیترو باکتر) روی محیط‌های مک کانکی آگار یا ائوزین متیلن بلو آگار بی رنگ هستند. بنابراین برای افتراق میان پاتوژن‌های روده ای، نمونه‌های مدفوع باید در محیط انتخابی تری مانند هکتون انتریک آگار یا گزیلوز لیزین دزواکسی کولات آگار کشت داده شوند. در صورتی که لاکتوز، سوکروز و یا سالیسین موجود در محیط کشت تخمیر شود، به دلیل تغییر رنگ معرف‌های برموتیمول بلو و فوشین اسیدی در اثر تغییر pH، کلنی‌های زرد رنگ یا قرمز مایل به زرد ایجاد می شود.

گونه‌ی سالمونلا و برخی دیگر از جنس‌های انترو باکتریاسه روی هکتون انتریک آگار

اگر ارگانیسم لاکتوز یا سالیسین را تخمیر نکند، کلنی‌ها به رنگ سبز (رنگ محیط کشت) مشاهده می شوند. اگر میکرو ارگانیسم H₂S تولید کند که یکی از خصوصیات مهم انترو باکتریاسه است، در ابتدا مرکز کلنی‌ها و پس از طولانی شدن زمان انکوباسیون، تمام کلنی سیاه می شود. کلنی سیاه خصوصیت اغلب گونه‌های سالمونلا روی هکتون آگار است.

شناسایی انتروباکتریاسه با استفاده از آزمایش سریع نقطه‌ای

تست‌های نقطه‌ای به‌منظور شناسایی سریع بسیاری از باکتری‌ها متداول می‌باشند. برای این روش از یک فیلتر کاغذی یا یک دیسک کاغذی استفاده می‌شود. برای انجام این روش چند کلنی از باکتری را توسط یک اپلیکاتور چوبی استریل برداشته و روی کاغذ تلقیح می کنند.

آزمایش اکسیداز نقطه‌ای

برخی از باکتری‌ها که دارای سیتوکروم اکسیداز یا ایندوفنل اکسیداز هستند. الکترون را از ترکیبات دهنده (NADH) به گیرنده‌های الکترون (O₂) منتقل می کنند. سوبسترای پارا فنیل دی آمین دی هیدرو کلراید، به‌عنوان پذیرنده ی مصنوعی الکترون برای آنزیم آکسیداز به کار می‌رود. این رنگ اکسید می‌شود و ایندو فنل بلو ایجاد می کند. در این تست، کاغذ به سوبسترا آغشته می‌شود. کلنی‌های میکروارگانیسم با سواب استریل بر روی کاغذ فیلتر کشیده می‌شود. تغییر رنگ فوری و ایجاد رنگ آبی تیره نشان دهنده مثبت بودن آزمایش است. (سمت راست شکل) انترو باکتریاسه اکسیداز منفی هستند.(سمت چپ شکل).

آزمایش ایندول نقطه‌ای

ایندول یکی از فرآورده‌های حاصل از تجزیه آمینو اسید تریپتوفان است. ایندول که در محیط غنی از تریپتوفان تولید می‌شود، می‌تواند با آلدئیدهای خاصی ترکیب شود و ترکیب رنگی ایجاد نماید.

برای انجام این تست، فیلتر کاغذی با ترکیبی مانند پارادی متیل آمینو بنزآلدئید (معرف کواکس) یا پارا دی متیل آمینو سینام آلدئید آغشته می‌شود. سپس کلنی باکتری با استفاده از سواب استریل بر روی آن کشیده می شود.

اگر از پارا دی متیل آمینو سینام آلدئید استفاده شود، رنگ آبی مایل به سبز، به سرعت در اثر واکنش با ایندول ایجاد می‌گردد. (سمت راست شکل).

در صورتی که از معرف کواکس استفاده شود، رنگ صورتی مایل به قرمز ایجاد می شود.

در این تصویر از پارا دی متیل آمینو سینام آلدئید استفاده شده، نتیجه آزمایش در کلنی سمت راست مثبت و درکلنی سمت چپ منفی می‌باشد. رنگ صورتی ایجاد شده در سمت چپ شکل به علت  تخمیرلاکتوز در محیط مک کانکی است. 

آزمایش متیل رد-وژپروسکوئر(MR-VP)

هر دو تست با استفاده از یک نوع محیط کشت در دو لوله آزمایش جداگانه انجام می‌شوند. تست متیل رد برای تعیین pH محصولات نهایی حاصل از تخمیر گلوکز به‌کار می‌رود. بعضی از انتروباکتریاسه هنگام تبدیل گلوکز به اسید پیروویک محصولات نهایی اسیدی تولید می‌کنند. (pH به پایین تر ۴/۴ می‌رسد) که رنگ معرف متیل رد را به قرمز تغییر می‌دهد.

برخی دیگر از این باکتری‌ها استوئین تولید می‌کنند که pH آن بالاتر از ۶ است و رنگ معرف را به رنگ زرد تغییر می‌دهند. در آزمایش وژ پروسکوئر، استوئین تشخیص داده می شود. در این تست، معرف آلفا نفتول و KOH به سوسپانسیون مایع کشت اضافه می‌شوند. استوئین به دی استیل اکسید می‌شود و موجب ایجاد رنگ قرمز توسط معرف‌ها می گردد (pH واکنش بالاتر از ۶ است).

لوله های سمت چپ MR مثبت (رنگ قرمز) و VP منفی را نشان می‌دهند. لوله های سمت راست MR منفی و VP مثبت (رنگ قرمز) را نشان می‌دهند.

آزمایش اُ نیتروفنیل بتا د گالاکتو-پیرانوزید (ONPG)

آنزیم بتا گالاکتوزیداز تخمیر لاکتوز را کاتالیز می‌کند. باکتری‌هایی که لاکتوز را به ‌طور سریع تخمیر می کنند، دارای آنزیم پرمه آزی هستند که موجب تسریع واکنش و ایجاد کلنی صورتی رنگ در سطح مک کانکی آگار می شود. تخمیر آهسته ی لاکتوز توسط بتا گالاکتوزیداز طی ۲ تا ۱۰ روز مشخص می‌شود. تست سریع ONPG در مدت زمان ۴ ساعت، تخمیر لاکتوز را توسط بتا گالاکتوزیداز نشان می‌دهد. در این تست، آنزیم بتا گالاکتوزیداز سوبسترای ONPG را به اُ نیتروفنیل (ترکیب زرد رنگ) و گالاکتوز تجزیه می کند. ایجاد رنگ زرد (لوله آزمایش سمت راست) نشان دهنده ی مثبت بودن آزمایش است. نتیجه آزمایش در سمت چپ نشان می دهد باکتری قادر به تخمیر لاکتوز نیست.

 آزمایش مصرف سیترات

بعضی از باکتری‌های متعلق به انتروباکتریاسه می‌توانند سیترات را به‌عنوان تنها منبع کربن مصرف کنند. برای انجام تست، یک کلنی باکتری در سطح شیب دار محیط سیترات اگار تلقیح می‌شود.

محیط سیترات به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌گردد. محیط کشت حاوی سیترات سدیم، نمک‌های آمونیوم و معرف برموتیمول بلو است. ایجاد رنگ آبی بعد از انکوباسیون نشان دهنده ی وجود محصولات نهایی قلیایی و مثبت بودن تست است (لوله آزمایش سمت چپ).

در صورتی که تست منفی باشد، تغییر رنگی مشاهده نمی‌شود (لوله آزمایش سمت راست).

 آزمایش فنیل آلانین دآمیناز (PAD)

بعضی از میکروارگانیسم‌ها می‌توانند یک گروه آمین را از آمینو اسید فنیل آلانین حذف کنند و فنیل پیروویک اسید ایجاد نمایند. برای بررسی نتیجه آزمایش، چند قطره کلراید فریک ۱۰% به محیط فنیل آلانین که میکروارگانیسم در آن رشد یافته است اضافه می شود. ایجاد رنگ سبز نشان دهنده ی مثبت بودن آزمایش است (لوله آزمایش سمت راست). نتیجه ی منفی با عدم تغییر رنگ محیط کشت مشخص می شود (لوله آزمایش سمت چپ).

آزمایش تجزیه اوره،

میکروارگانیسم‌هایی که دارای آنزیم اوره آز هستند، می توانند اوره را به آمونیوم و CO₂ تجزیه کنند. با قلیایی شدن محیط کشت، رنگ معرف فنل رد صورتی پر رنگ می شود که نشان دهنده مثبت بودن آزمایش است.

در لوله سمت چپ پروتئوس میرابیلیس کشت یافته است که طی ۲ تا ۴ ساعت اوره را تجزیه می کند. در لوله آزمایش وسط کلبسیلا پنومونیه کشت یافته است که اوره را طی ۱۸ تا ۲۴ ساعت هیدرولیز می کند و در لوله‌ی سمت راست اشرشیا کلی رشد کرده است که اوره آز منفی است.

آزمایش فنیل آلانین د آمیناز و آزمایش اُوره

آزمایش هردو تست در چهار گونه ازانتروبا-کتریاسه مثبت است. پروتئوس میرابیلیس، پروتئوس ولگاریس، مورگانلا مورگانی و پروویدنسیا رتگری.

اگر ارگانیسم بر روی آگار خون دار تولید سوآرمینگ کند، یکی از گونه‌های پروتئوس است. یک تست نقطه‌ای ایندول می تواند گونه را شناسایی کند. پروتئوس میرابیلیس ایندول منفی و پروتئوس ولگاریس ایندول مثبت می باشد. آزمایش سیترات برای افتراق غیر تخمیر کننده ها است. مورگانلا مورگانی سیترات منفی و پروویدنسیا رتگری سیترات مثبت است.

انواع واکنش‌ها در محیط کشت سیترات/ رامنوز

در قسمت فوقانی این محیط کشت (شرایط هوازی) توانایی مصرف سیترات بررسی می‌شود و در قسمت پایینی (شرایط بی‌هوازی) تخمیر رامنوز ارزیابی می‌شود.

تصویر موجود چهار حالت این محیط کشت را نشان می دهد. 

واکنش‌های مخصوص گونه سالمونلا به جز سالمونلا تیفی

 واکنش‌های مخصوص سالمونلا تیفی

واکنش‌های مخصوص یرسینیا انتروکولیتیکا

واکنش های مخصوص پروتئوس ولگاریس

تشخیص اشرشیا کلی با استفاده از نوار MICRO-ID 

این نوارها حاوی ۱۵ تست بیوشیمیایی برای تشخیص سریع (۴ ساعته) انتروباکتریاسه هستند.

در این آزمایش از سوسپانسیون غلیظ باکتری استفاده می‌شود.

این تست‌ها عبارتند از

• وژپرسکوئر(VP)
• نیترات (N)
• فنیل آلانین دآمیناز (PD)
• H₂S 
• ایندول(I)
• اورنیتین دکربوکسیلاز (OD)
• لیزین دکربوکسیلاز (LD)
• تجزیه مالونات (M)
• تجزیه اوره (U)
• هیدرولیز اسکولین (E)
• ONPG

تخمیر قند های آرابینوز (ARAB)، ادونیتول(ADON)، اینوزیتول (INOS)، و سوربیتول (SORB).

نتایج آزمایشات با چشم دیده شده و با جدول تشخیصی موجود در کتاب MICRO-ID مقایسه می گردد. نتایج در جدول شرح داده شده است.

تطبیق مورفولوژی کلنی با مشخصات بیوشیمیایی،

یکی از مراحل مهم تشخیص نهایی یک سویه، تطبیق واکنش بیوشیمیایی با مورفولوژی کلنی و واکنش‌هایی است که در اولین کشت پلیت انجام می‌شود.

در این مثال، کلنی‌های گونه‌ای از سالمونلا روی محیط کشت هکتون انتریک آگار H₂S تولید کرده است و همچنین تولید H₂S در کیت API 20E نشان شده است.